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免疫組化實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)點(diǎn)擊次數(shù):2733 更新時(shí)間:2017-03-09

免疫組化實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1. 蘇木素復(fù)染時(shí)間需要摸索,尤其陽性染色也在細(xì)胞核上。

 

2. DAB顯色時(shí)間需要達(dá)到*化,鏡下觀察達(dá)到陽性染色明顯但背景不太深。

 

3. 抗體孵育時(shí)間和抗體濃度需要摸索。尤其一抗孵育溫度在4度。

 

4. 切片脫蠟和水化要充分;加反應(yīng)液時(shí)要覆蓋組織充分;每次加液前甩干洗滌液,但又防止干片;用組化筆畫圈時(shí)盡量畫大一點(diǎn),否則墨水排斥液體,引起片周邊干片。

 

5. 片子著色不均勻的原因如下:

 

(1) 脫蠟不充分??梢?0 ℃烤20 min,立即放入新鮮的xylene1;

 

(2)水化不全。應(yīng)經(jīng)常配制新鮮的梯度乙醇;

 

(3)抗體沒混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑;

 

(4) 抗體孵育時(shí),切片放傾斜;

 

(5)抗體孵育后PBS沖洗不充分。

 

(6) 制片厚薄不均勻等問題。染片盒不平,切片傾斜。

 

6. 一抗從4 ℃拿出后,為什么有人說要37度復(fù)溫,目的是什么?

 

(1) 一方面,防止切片從4 ℃直接放入PBS易脫片;

 

(2)另一方面,使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要,但對表達(dá)較弱的抗原可能有用,4 ℃和37 ℃度時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同,前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者,后者結(jié)合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。

 

7. 切片染色后背景太深,不易區(qū)分特異性與非特異性著色?

 

(1) 抗體孵育時(shí)間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制;

 

(2) 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色,建議試用單克隆抗體看看;

 

(3)內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高,需要通過延長滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色;

 

(4)非特異性組分與抗體結(jié)合,這需要通過延長二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果;

 

(5) DAB顯色時(shí)間過長或濃度過高;

 

(6) PBS沖洗不充分,殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色;

 

(7) 標(biāo)本染色過程中出現(xiàn)干片,易增強(qiáng)非特異性著色。

 

 

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