胚胎干細胞培養(yǎng)操作規(guī)程

維持ES細胞處于未分化狀態(tài)：

ES細胞培養(yǎng)用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培養(yǎng)基來阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1％明膠的平板作為粘附細胞的基質(zhì)。建議每2－3天從達到80％－90％融合的平板按1：8的比率傳代細胞一次，細胞傳代以后，在將細胞接種在0.1％明膠包被的培養(yǎng)皿之前，通過預先將細胞接種在沒有經(jīng)過包被的組織培養(yǎng)板2個小時，使分化細胞粘附，從而將分化和未分化細胞分開。將細胞全程置于37℃，5％CO2，100％濕度條件下培養(yǎng)。

培養(yǎng)基：ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（該溶液也能用于EB培養(yǎng)基--見下文）。分裝在50ml FALCON管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。通過將21ml該溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基，0.2μm濾膜過濾。貯存于4℃。
注：一瓶DMEM是500ml。

貯存液：DMEM（高糖）、馬血清（HS）、L-谷氨酰胺（200mM）、MEM NEAA（10mM）、HEPES（1M）、β-巰基乙醇（55Mm）、PEST、ESGRO。
復蘇細胞：細胞被凍存在10％二甲基亞砜（DMSO）中防止結(jié)晶的形成，結(jié)晶的形成會損害細胞。然而，二甲基亞砜對細胞有毒性，快速的進行細胞復蘇是很重要的。

操作步驟：
1．從液氮中取出一管細胞；
2．將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內(nèi)溶液恰好*溶解）；
3．將細胞轉(zhuǎn)移到一15ml Falcon管中；
4．加入5ml ES培養(yǎng)基（用培養(yǎng)基沖洗凍存管）；
5．離心3分鐘；
6．棄上清，用2ml ES培養(yǎng)基重懸細胞，至少吹打10次；
7．接種在明膠包被（見下文）的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿；
8．孵育。

凍存細胞
凍存液：90％HS和10％二甲基亞砜
步驟：
1．1×PBS洗細胞并留少許PBS在培養(yǎng)皿內(nèi)；
2．用細胞刮刀收集細胞；
3．將細胞轉(zhuǎn)入15ml Falcon管內(nèi)并離心3分鐘；
4．棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中（10cm的培養(yǎng)皿用2ml，15cm的培養(yǎng)皿用6－7ml。）
5．分裝于凍存管內(nèi)，每管1ml；
6．置－80℃過夜，第二天移入液氮。

明膠包被：準備500ml 0.1％明膠溶液
1．將0.5g明膠溶解在500ml無鈣鎂的PBS中（50－65℃水浴15～30分鐘）。
2．在溶液沒有冷卻的情況下通過0.2μm濾膜過濾，貯存在4℃。
包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿
1．加入足量的明膠溶液覆蓋培養(yǎng)平面（15cm培養(yǎng)皿加2ml，10cm培養(yǎng)皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能*覆蓋培養(yǎng)表面就行了。）；
2．置室溫30分鐘；
3．去除明膠溶液，將培養(yǎng)板貯存在包裝袋中室溫放置，將板子平方，以免明膠污染蓋子和流出培養(yǎng)板。