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技術(shù)文章

IL-4拮抗IFN的抗病毒活性測(cè)定點(diǎn)擊次數(shù):1725 更新時(shí)間:2011-05-23

                                         IL-4拮抗IFN的抗病毒活性測(cè)定

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        IL-4能阻斷IFN對(duì)L929細(xì)胞的保護(hù)作用,其拮抗程度與IL-4濃度相關(guān),據(jù)此可通過對(duì)L929細(xì)胞保護(hù)作用的抑制率來反映樣本中IL-4的含量。
(1)、取生長良好的L929細(xì)胞傾去培養(yǎng)液,加入0.25%胰酶消化后,充分洗滌細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105—3×105/mL,每孔加100uL,37℃,5%C02溫箱中培養(yǎng)24h。
(2)、采用9—10日齡雞胚,制備成纖維細(xì)胞單層培養(yǎng),接種適量VSV病毒。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)+++—++++時(shí),收獲病毒,并進(jìn)行病毒TCID50測(cè)定。
(3)、將待檢上清和rlL-4分別與4U/mL IFN混合,在L929細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)加100uL。37~C,5%C02溫箱中孵育24h。
(4)、VSV攻擊:每孔加100uL病毒懸液,含200TCID;置37℃,5%C02溫箱培養(yǎng)48h,待病毒對(duì)照孔病變達(dá)+++—++++,細(xì)胞對(duì)照正常時(shí),測(cè)定結(jié)果。
(5)、將培養(yǎng)液全部倒出,用Hanks液洗3次;每孔加入100uL0.5%結(jié)晶紫染色液,染10—20rain棄去,Hanks液洗3次,加入95%酒精。放小型振蕩器上振搖15min左右,待細(xì)胞內(nèi)染料*溶解。用分光光度計(jì)540nm波長測(cè)OD值,以準(zhǔn)確客觀地反映細(xì)胞存活數(shù)量。
(6)、注意事項(xiàng):
①L929細(xì)胞在營養(yǎng)條件不良時(shí),可呈圓形漂浮狀,此時(shí)更換培養(yǎng)液可使其恢復(fù)為梭形貼壁細(xì)胞;
②L929細(xì)胞要均勻分散于培養(yǎng)板孔中,否則可能造成某個(gè)部位細(xì)胞過密,另一部分過稀,將影響細(xì)胞單層的形成。
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