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技術(shù)文章

學(xué)習(xí)凋亡試劑盒的檢測(cè)步驟點(diǎn)擊次數(shù):1485 更新時(shí)間:2015-12-21

     實(shí)驗(yàn)方法
    該實(shí)驗(yàn)采用的是經(jīng)過優(yōu)化的喜樹堿誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞系凋亡實(shí)驗(yàn)條件。其他類型的細(xì)胞需做相應(yīng)調(diào)整。
    該試劑盒在傳統(tǒng)及Attune?聲波聚焦流式細(xì)胞儀上驗(yàn)證過,使用Attune?聲波聚焦流式細(xì)胞儀時(shí),各種流速(25 μL/min 到 1,000 μL/min)都可以。
    1.用有效方法誘導(dǎo)凋亡;設(shè)一不加誘導(dǎo)的陰性對(duì)照。
    2.孵育之后收集細(xì)胞并用冷的PBS洗滌。
    3.制備1×annexin V 結(jié)合緩沖液:按10次分析的量計(jì)算,加1 mL試劑C到4ml的去離子水中。
    4.制備100μg/mL的PI工作液:用45μl 1×annexin V 結(jié)合緩沖液稀釋5μl試劑B,剩余可保存?zhèn)溆谩?/div>
    5.再次離心步驟2中收集的細(xì)胞,棄去上清,重懸在1×annexinV 結(jié)合緩沖液。計(jì)數(shù)并用上述緩沖液稀釋至約1 × 106 cells/mL。按每次實(shí)驗(yàn)用量100μl準(zhǔn)備充分。
    6.在每100μl細(xì)胞懸液中加入5μl試劑A和1μl步驟4制備的PI工作液。
    7. 室溫孵育15min。
    8. 孵育結(jié)束,加400μl 1×annexin V 結(jié)合緩沖液,輕輕混勻后置于冰上。
    9.盡快對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行分析。可用FL1檢測(cè)530nm激發(fā)光,F(xiàn)L3檢測(cè)>575nm的激發(fā)光。細(xì)胞群將被分為三組:活細(xì)胞顯示弱熒光,凋亡細(xì)胞顯示綠色熒光,而死細(xì)胞則同時(shí)發(fā)紅、綠熒光。
    10. 可用熒光顯微鏡驗(yàn)證結(jié)果,適用檢測(cè)FITC、TRITC或Texas Red?的濾光片檢測(cè)。
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